海洋細(xì)菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在海洋物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)以及生態(tài)調(diào)控等方面具有重要作用.海洋細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與種類組成直接影響整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展，同時(shí)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)又與其棲息的環(huán)境密切相關(guān).海洋細(xì)菌的分類鑒定及其群落結(jié)構(gòu)的分析方法包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類(金光，2011)，表型鑒定法包括細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、細(xì)胞組分水平、蛋白質(zhì)水平上的鑒定，分子遺傳學(xué)鑒定法是在核酸水平上的鑒定，包括核酸雜交、PCR 技術(shù)、16S rRNA序列分析、全基因組測(cè)序等.

　　變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)最早是由Fischer和Lerman于1983年創(chuàng)立的，是根據(jù)在不同濃度的變性劑中DNA片段解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的片段分開.近年來(lái)PCR-DGGE技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析中.

　　大亞灣位于南海北部，是廣東省重要的養(yǎng)殖基地，也是大亞灣核電站和惠州港所在地.由于近些年該海域污染日趨嚴(yán)重，海洋環(huán)境狀況發(fā)生顯著變化，浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生明顯變化.目前有關(guān)大亞灣浮游細(xì)菌方面的報(bào)道不多，尚未有浮游細(xì)菌DNA指紋及分子多樣性方面的報(bào)道.為了了解大亞灣海域浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及分子多樣性，本文采集了大亞灣海域表層水樣，利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)浮游細(xì)菌的DNA指紋進(jìn)行了研究，以揭示DGGE技術(shù)等分子手段在浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析上的應(yīng)用.

　　2 材料與方法

　　2.1 樣品的采集與處理

　　在廣東省大亞灣海域設(shè)置的9個(gè)采樣點(diǎn)(圖 1).S1～S3位于大亞灣澳頭海域，該海域毗鄰惠州市澳頭鎮(zhèn)，是重要網(wǎng)箱魚類養(yǎng)殖基地;S4～S6位于大鵬澳海域，該海域位于深圳市大鵬鎮(zhèn)，灣內(nèi)有魚類和貝類養(yǎng)殖區(qū)，同時(shí)也是大亞灣核電站和嶺澳核電站所在地;S7～S8位于大亞灣灣口，受到養(yǎng)殖和人類活動(dòng)的影響較小.分別于2010年12月15日(2010年冬)、2011年6月8日(2011年夏)采集表層水樣，每個(gè)采樣點(diǎn)采集水樣9 L，并在現(xiàn)場(chǎng)用中性魯哥試劑固定.固定的水樣先用孔徑為10 μm網(wǎng)篩過(guò)濾，然后再依次用GF/A濾膜(Whatman)以及 0.2 μm 聚醚砜濾膜(Millipore)過(guò)濾，濾膜上的樣品置于1.8 mL SET裂解緩沖液(20% 蔗糖，50 mmol · L-1 Tris-HCl pH 7.6，50 mmol · L-1 EDTA)中，儲(chǔ)存在-20 ℃待分析.

 

　　圖1 大亞灣采樣點(diǎn)的設(shè)置

　　2.2 水環(huán)境因子的測(cè)定

　　水溫、鹽度、電導(dǎo)率、溶解氧(DO)、pH值等理化因子通過(guò)采用美國(guó)YSI-561多參數(shù)水質(zhì)分析儀進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，透明度用薩氏盤測(cè)定.

　　2.3 DNA的提取及16S rRNA基因V3區(qū)的PCR擴(kuò)增

　　利用美國(guó)Omega公司細(xì)菌基因組DNA的提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書.采用原核生物通用引物Eubac341F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和Eubac517R(5′- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)對(duì)細(xì)菌rRNA基因16S V3區(qū)的保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Muyzer et al., 1993; Celussi et al., 2008)，并在Eubac341F 5′端添加GC2夾子:5′- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC-3′)，擴(kuò)增體系為30 μL，擴(kuò)增體系中各組分含量為別為：10×buffer 3 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 21 μL.PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，65~55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s每個(gè)循環(huán)降0.5 ℃，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s)× 20個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7min，4 ℃ ∞.擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，用1×的gelgreen工作液進(jìn)行膠前染色.

　　2.4 DGGE分析

　　取PCR產(chǎn)物30 μL，在Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，DGGE條件為：丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù) 8%，變性梯度40%～64%(100%的變性劑濃度為7 mol · L-1尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%去離子甲酰胺)，并在上述兩種凝膠液中分別加入100 μL 10%的過(guò)硫酸銨(ASP)和10 μL的四甲基乙二胺(TEMED).先用200 V預(yù)電泳20 min左右以去除膠空中的雜質(zhì)，然后加入PCR產(chǎn)物樣品，200 V電泳5 h.200 V電壓電泳20 min，然后再用 200 V電壓電泳5 h，緩沖液為1 × TAE，電泳結(jié)束后用超純水沖洗兩次，后置于1×SybrGreen工作液中避光染色30 min，用 Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc2000TM)進(jìn)行拍照，DNA指紋圖譜用Quantity one軟件進(jìn)行分析.

　　2.5 數(shù)據(jù)分析與處理

　　2.5.1 Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)

 

　　式中，n為每個(gè)泳道的條帶數(shù)目，Pi=Ni/N，Ni為第i條條帶的峰面積，N為該泳道所有條帶的峰面積總和.

　　2.5.2 Pielou均勻度指數(shù)(J)

 

　　其中，H′為某泳道的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)，S為對(duì)應(yīng)泳道的DNA指紋條帶數(shù).

　　2.5.3 統(tǒng)計(jì)分析

　　利用SPSS 18.0對(duì)冬季和夏季浮游細(xì)菌DNA指紋條帶數(shù)、H′和J值進(jìn)行顯著性差異t檢驗(yàn)，對(duì)DNA指紋條帶數(shù)與環(huán)境因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析.

　　3 結(jié)果

　　3.1 水環(huán)境因子

　　表 1列出了兩次調(diào)查中大亞灣海域各站位的水環(huán)境因子，可以看出大亞灣海域水溫較高，即使在12月份的冬季，水溫仍可以達(dá)到20 ℃左右;夏季水溫則高達(dá)29 ℃左右.各站位間水溫差異不大，一般小于1 ℃.兩次調(diào)查期間鹽度相近，在33~34之間.冬季pH值略高于夏季，而DO值和透明度則明顯高于夏季.

　　表1 2010年冬及2011年夏大亞灣海域水環(huán)境因子

　　3.2 DGGE指紋圖譜分析

　　2010年冬季和2011年夏季大亞灣海域浮游細(xì)菌的DNA指紋圖譜見圖 2.結(jié)果顯示，條帶分離較好，冬季條帶亮度較夏季弱，冬季浮游細(xì)菌豐度較低.從帶型模擬圖(圖 3)中可以更清楚看到各站位浮游細(xì)菌DNA指紋圖譜，冬季和夏季樣品中分別共得到32條和33條條帶.

　　圖2 大亞灣海域浮游細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)DNA圖譜(a. 2010年冬，b. 2011年夏)

　　圖3 大亞灣海域浮游細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜分析帶型圖(其中水平軸上的數(shù)字(1～9)為站點(diǎn)編號(hào)，百分比是與標(biāo)準(zhǔn)泳道的匹配度; 垂直軸上的數(shù)字為DNA條帶編號(hào)(a. 2010年冬，b. 2011年夏))

　　冬季樣品共有的優(yōu)勢(shì)條帶較多，如灰度較大的優(yōu)勢(shì)菌群條帶1、2、5、8、10、11、12在各個(gè)站位均有出現(xiàn)，條帶1和條帶2為最為常見優(yōu)勢(shì)條帶，條帶11和12在S2以及S5~S8站位較為豐富(圖 3a).以S7為標(biāo)準(zhǔn)，其余站位與之匹配度為49.8%~76.7%之間，位于大鵬澳海域的幾個(gè)站位與S7的匹配度較高，而位于澳頭海域的S1~S3與之匹配度較低，說(shuō)明這兩個(gè)海域浮游細(xì)菌存在一定空間異質(zhì)性，但整體來(lái)說(shuō)比較均一.

　　夏季樣品中共同的優(yōu)勢(shì)條帶較少(圖 3b)，條帶2在每個(gè)站點(diǎn)均出現(xiàn)，且灰度值比較大，為優(yōu)勢(shì)菌群;但有些灰度值較大的條帶(優(yōu)勢(shì)菌群)只在部分采樣點(diǎn)出現(xiàn)，如條帶3、10、21、31.以S3為標(biāo)準(zhǔn)，所有泳道與S3的匹配度差別不大，在60.0%~68.6%之間(圖 3b)，說(shuō)明夏季浮游細(xì)菌空間分布差異較低.

　　3.3 浮游細(xì)菌DNA指紋多樣性

　　大亞灣海域浮游細(xì)菌DNA指紋條帶數(shù)見圖 4.各站位條帶數(shù)變化不大，冬季為18~22條，平均為20條;夏季較高，為19~25條，平均為23條.夏季指紋條帶數(shù)明顯高于冬季(p<0.01).

　　圖4 大亞灣浮游細(xì)菌DNA指紋條帶數(shù)

　　與DNA指紋條帶數(shù)不同，冬季DNA指紋的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)略高于夏季(p>0.05)，冬季和夏季H′值的變化范圍分別為2.51~2.88和2.48~2.79;而均勻度(J)則在冬季明顯較高(p<0.01)，冬季和夏季分別為0.83~0.93以及0.80~0.88.

　　3.4 浮游細(xì)菌DNA指紋與環(huán)境因子的關(guān)系

　　從浮游細(xì)菌與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系可以看出，DNA指紋條帶數(shù)與環(huán)境因子密切相關(guān)，其中與溫度和鹽度明顯正相關(guān)(p<0.05)，而與pH、DO以及透明度明顯負(fù)相關(guān)(p<0.05或p<0.01)，結(jié)果說(shuō)明高溫高鹽可促進(jìn)浮游細(xì)菌多樣性，而pH、DO、透明度下降等水質(zhì)惡化現(xiàn)象則可降低浮游細(xì)菌的種類豐富程度.H′值僅與J值呈明顯正相關(guān);而J則與水溫明顯負(fù)相關(guān)，與pH和DO明顯正相關(guān).各種環(huán)境因子之間幾乎均呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)關(guān)系，其中水溫與pH、DO、透明度均明顯負(fù)相關(guān)(p<0.05或p<0.01)，說(shuō)明夏季水質(zhì)較冬季差;而DO又與pH和透明度明顯正相關(guān)(p<0.01).

　　圖5 大亞灣浮游細(xì)菌DNA指紋的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)和PieLou均勻度(J)(a. H′，b. J)

　　表2 浮游細(xì)菌DNA指紋及其多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系

　　4 討論

　　4.1 大亞灣海域浮游細(xì)菌多樣性

　　浮游細(xì)菌種類豐富程度以及DNA指紋條帶數(shù)與海域環(huán)境狀況以及富營(yíng)養(yǎng)化程度密切相關(guān)，在富營(yíng)養(yǎng)化海區(qū)細(xì)菌豐度較高，但種類數(shù)和多樣性下降.在本研究中，DNA指紋條帶數(shù)與pH、DO以及透明度均呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明水質(zhì)能影響浮游細(xì)菌的種類數(shù).大亞灣海域浮游細(xì)菌種類較豐富，每個(gè)樣品觀察到的DNA條帶數(shù)為18~25條，冬季和夏季分別檢測(cè)到32和33條帶.在同期的可培養(yǎng)浮游細(xì)菌調(diào)查中，共分離培養(yǎng)了70株菌株，根據(jù)16S rDNA序列分析，獲得了35個(gè)不同序列，細(xì)菌種類數(shù)與本研究相近.大亞灣海域浮游細(xì)菌的DNA指紋條帶數(shù)明顯高于以往的研究報(bào)道，如黃海冷水團(tuán)海域的浮游細(xì)菌DNA指紋條帶數(shù)僅17條左右(劉敏等，2008)，東海長(zhǎng)江口赤潮高發(fā)區(qū)各站位浮游細(xì)菌指紋條帶數(shù)不超過(guò)20條，葡萄牙的Ria de Aveiro海域浮游細(xì)菌的條帶數(shù)與本研究相近，為17~24條;而與地中海西北部海域浮游細(xì)菌的DNA指紋條帶數(shù)相近，為26~36條.

　　但是大亞灣海域浮游細(xì)菌的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)較低，平均僅為2.63，低于其他海域浮游細(xì)菌多樣性指數(shù)，并且低于同期調(diào)查的本海域可培養(yǎng)浮游細(xì)菌的多樣性指數(shù).大亞灣海域DNA指紋條帶較豐富，說(shuō)明該海域物種數(shù)較豐富，但某些耐受能力較強(qiáng)的物種在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)，致使細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)多樣性下降.從DNA指紋圖譜和帶型模擬圖中也可看出，優(yōu)勢(shì)種類亮度較高，優(yōu)勢(shì)度明顯.大亞灣海域曾被認(rèn)為是我國(guó)近岸海域水質(zhì)較好的港灣之一，但近年來(lái)富營(yíng)養(yǎng)化程度明顯上升，而且營(yíng)養(yǎng)鹽補(bǔ)充及時(shí)，初級(jí)生產(chǎn)力較高(孫翠慈等，2006).在近年來(lái)的浮游植物調(diào)查中，也發(fā)現(xiàn)大亞灣浮游植物種類豐富，數(shù)量較高，浮游植物種類多樣性指數(shù)較低的現(xiàn)象.

　　雖然夏季浮游細(xì)菌的DNA指紋條帶數(shù)明顯高于冬季，但冬季的種類多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)略高于夏季.一般在溫帶海域浮游細(xì)菌季節(jié)變化明顯，冬季細(xì)菌種類多樣性和數(shù)量均明顯低于夏季.大亞灣位于亞熱帶，全年平均水溫在25 ℃以上，冬季水溫也較高，即使在12月份水溫也達(dá)到20 ℃左右.因此，浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)不會(huì)受到冬季低溫的影響，但浮游細(xì)菌DNA指紋條帶數(shù)仍與水溫呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，而H′則與水溫負(fù)相關(guān)，結(jié)果說(shuō)明高溫能促進(jìn)細(xì)菌種類數(shù)，但種類多樣性下降.大亞灣海域浮游植物群落結(jié)構(gòu)與浮游細(xì)菌相近，同樣是夏秋季節(jié)浮游植物種類豐富，數(shù)量較高，但是多樣性指數(shù)較低;冬季雖然種類數(shù)下降，數(shù)量也同時(shí)下降，各物種分布更加均勻，種類多樣性上升.而浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化主要由水體中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)引起以及有機(jī)質(zhì)有關(guān)，大亞灣屬于一個(gè)封閉性養(yǎng)殖內(nèi)灣，有機(jī)物質(zhì)含量豐富，而冬季浮游植物高峰也為浮游細(xì)菌提供了豐富的有機(jī)質(zhì).

　　4.2 DGGE技術(shù)在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

　　DGGE技術(shù)能在一定程度上較全面反映浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，不能培養(yǎng)的細(xì)菌特別是未能培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌群能在DGGE圖譜中得到反映.如與本研究同時(shí)采集的大亞灣水樣，用培養(yǎng)法一個(gè)樣品最多能培養(yǎng)出12個(gè)菌株(江曉亮等，2013)，而DGGE技術(shù)則能顯示出18~25個(gè)條帶.但是利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析尚存在一些不足，在PCR-DGGE過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)種對(duì)非優(yōu)勢(shì)種具有屏蔽作用，DNA樣品中低于1%的種類無(wú)法在DGGE圖譜中顯現(xiàn)出來(lái)(Muyzer et al., 1993);而不同細(xì)菌之間基因的拷貝數(shù)以及基因組大小的差異性也會(huì)對(duì)細(xì)菌DNA指紋數(shù)及亮度產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致該技術(shù)對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)產(chǎn)生偏差.

　　此外PCR-DGGE技術(shù)不能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定，僅能相對(duì)反映細(xì)菌的種類多樣性.如果需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步分類鑒定，需要切膠測(cè)序.而且PCR-DGGE技術(shù)不能準(zhǔn)確對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量分析，DGGE條帶的強(qiáng)弱程度只能表示不同種類的細(xì)菌之間的相對(duì)豐度.雖然本研究未對(duì)DGGE條帶進(jìn)行切膠測(cè)序，但在同期調(diào)查中對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了16s rDNA 序列測(cè)定(江曉亮等，2013)，分析鑒定了35種可培養(yǎng)細(xì)菌，其中以α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria)為分離最多的兩大類，此外還包括β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、蓋球菌屬(Kytococcus)以及間胞囊菌屬(Intrasporangium)的菌株.

　　由此可見，雖然PCR-DGGE技術(shù)在研究群落動(dòng)態(tài)和多樣性方面存在優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)無(wú)法給出細(xì)菌的代謝活性、數(shù)量和基因表達(dá)水平方面的信息，必須與其他技術(shù)相結(jié)合以彌補(bǔ)其本身的不足，如酶學(xué)分析均可以提供群落代謝活性特征，熒光原位雜交技術(shù)可以提供細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量，而通過(guò)與熒光定量PCR結(jié)合，可以對(duì)群落的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行定量分析.因此，PCR-DGGE技術(shù)與其他分類以及分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后，可更好地反映海洋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能.

　　4 結(jié)論

　　1)大亞灣海域浮游細(xì)菌DNA指紋條帶豐富，在2010年冬和2011年夏的調(diào)查中共分別得到32和33條DNA指紋條帶，每個(gè)樣品的DNA條帶數(shù)為18~25條.

　　2)高溫高鹽可促進(jìn)浮游細(xì)菌多樣性，而pH、DO、透明度下降則可降低浮游細(xì)菌的種類豐富程度.

　　3)夏季DNA指紋條帶數(shù)明顯高于冬季，但冬季的多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)較高.

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